前跋

根据Clinicaltrials官网数据，截至2022年6月16日，全球已展开42278项细胞治疗相关的临床研究；其中，中国有4221项。在全球1183项CAR-T临床研究中，中国有592项，占比过半；在全球59项TCR-T临床研究中，美国28项，中国2项。在今年6月份举行的ASCO上，全球细胞治疗领域共有10家中国药企和14家海外细胞治疗公司发布临床结果。

据弗罗斯特沙利文预计，我国细胞治疗市场规模将由2021年的13亿元，增长至2030年的584亿元，年均增速高达53%。另有数据显示，我国细胞和基因治疗市场有望在2025年达到25.9亿美元，以276%的复合增长率增长。

CAR-T细胞疗法到目前为止，全球范围内注册的关于免疫疗法的临床研究项目已经超过7000例，其中在我国进行的有519例。CAR-T细胞疗法被公认为是目前最具前景的肿瘤治疗方式之一。

2017年8月：诺华公司研发的Kymriah获FDA批准上市，用于治疗复发性/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(R/R B-ALL)儿童及年轻患者(≤25岁)，这是全球首个获批的CAR-T疗法，同时也是FDA批准的第一款基因疗法，开创了CAR-T疗法治疗癌症的先河。

2022年6月底，吉利德科学旗下公司Kite宣布，欧盟委员会(EC)已批准其CAR-T细胞疗法Yescarta，用于治疗在三线及以上全身治疗后患有复发或难治性滤泡性淋巴瘤的成年患者。

同期，百时美施贵宝宣布，美国FDA批准其CAR-T细胞疗法Breyanzi用于治疗前一次治疗后的复发或难治性大B细胞淋巴瘤。

国内2021年6月批准上市复星凯特的CAR-T产品：阿基仑赛注射液（奕凯达）；

国内2022年9月上市：药明巨诺的瑞基奥仑赛注射液（倍诺达）；

 ——标志着国内进入细胞治疗的商业化大时代，CAR-T使血液瘤临床治愈成为现实。

奕凯达：是一种自体免疫细胞注射剂，由携带CD19 CAR基因的逆转录病毒载体进行基因修饰的自体靶向人CD19嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）制备，是中国首个获批的CAR-T药物。它是复星凯特引进美国Kite（吉利德科学旗下公司，全球首个获批治疗非霍奇金淋巴瘤的CAR-T产品）的Yescarta后，进行技术转移并获授权在中国进行本地化生产的靶向人CD19自体CAR-T细胞治疗产品。奕凯达获批是基于复星凯特在中国开展的一项单臂、开放性、多中心桥接临床试验结果，在难治性侵袭性弥漫大B细胞淋巴瘤中国患者中验证了其有效性和安全性。

倍诺达：是国内第2款获批上市的CAR-T产品，也是国内首个获批的1类CAR-T、全球第6款获批上市的CAR-T产品。瑞基奥仑赛注射液是在美国Juno公司JCAR017的基础上，由药明巨诺自主开发的CAR-T产品。2022年4月3日CDE已授予倍诺达用于治疗套细胞淋巴瘤的突破性治疗药物认定。

So...近两年，CAR-T细胞疗法作为肿瘤免疫治疗界的黑马，成为免疫细胞疗法的大热点。

二、什么是细胞免疫治疗？

细胞治疗又称为细胞移植或细胞移植治疗，即利用患者自体(或异体)的成体细胞(或干细胞)对组织、器官进行修复的治疗方法。目前，临床上应用最广泛的细胞治疗方式为免疫细胞疗法和干细胞疗法两种。

•免疫细胞治疗是指将免疫细胞经过培养、激活等一系列体外操作后回输到患者体内，用于治疗肿瘤或免疫相关疾病。

•干细胞移植治疗，是一门先进的医学技术，2009年卫生部将干细胞技术归入“第三类医疗技术” 。所谓干细胞，是一种未充分分化、尚不成熟的细胞，具有再生为各种组织器官和人体细胞的潜在功能。干细胞移植治疗是把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的。干细胞移植治疗范围很广，一般能治疗神经系统疾病、免疫系统疾病、还有其他的一些内外科疾病。干细胞在医学界被称为“万用细胞”，它可以分化成多种功能细胞或组织器官。因在APSC多能细胞实验室中培育出来的干细胞具有“无限”增殖、多向分化潜能，具有造血支持、免疫调控和自我复制等特点。

三、什么是CAR-T细胞疗法？

CAR-T：Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。

CAR-T细胞免疫疗法原理：

① 利用病人自身的免疫细胞实现对癌细胞的清除；

② 主要目的是加强免疫系统内在的抗癌能力；

③ 从患者的血液中提取T细胞，并在体外对这些细胞进行基因改造，给它们装上识别癌细胞表面抗原的“嵌合抗原受体”（CAR）。然后，将这些改造之后的细胞进行大量扩增，再输注回患者体内，从而增大CAR-T细胞在体内的存活率；

④ CAR-T细胞在患者体内一旦存活，将继续繁殖，最终实现对癌细胞的攻击。

四、CAR-T细胞疗法进程

① 1989年美国的ZeligEshhar教授首次提出CAR-T细胞疗法的概念。

② 2002年，基于CD28的第二代Car-T细胞出现；在2003年，验证了CD19是优秀的CAR靶点。

③ 2004年，基于4-1BB的第三代Car-T细胞被发展出来，第三代Car-T细胞增加了多个共刺激受体结构域，进一步增强了Car-T细胞的活性。

④ 第四代CAR-T细胞，也称为“TRUCK”细胞，被另外的可诱导细胞因子工程化，是可以在激活时分泌细胞因子的CAR。

⑤ 第五代：通用型CAR-T。

目前第三、四代、五代Car-T细胞的发展并不完善，临床上应用最多的为第二代Car-T细胞，主要用于血液恶性肿瘤的治疗，且具有很好的疗效。

• 第一代CAR-T：

以色列科学家Zelig Eshhar想到，主动给T细胞装上一个能够识别肿瘤细胞特异性抗原的受体。基因工程技术的发展使得这种想法具有了可操作性。为了克服MHC限制性，Eshhar首先找到一个合适的TAA，然后给T细胞装上对应的scFv，他将这种经过基因修饰的T细胞叫做T-bodies，这就是CAR-T的雏形。然而，因为缺乏共刺激信号，T细胞往往会未老先衰，所以第一代CAR-T的试验基本上是失败的。

• 第二代CAR-T：

在第一代CAR-T的基础上，宾夕法尼亚大学的Carl H. June 团队设计了以CD19为靶点，4-1BB做共刺激结构域的第二代CAR-T。

2012年，6岁女孩Emily Whitehead在经历过急性淋巴性白血病两次复发后，加入了诺华CTL019疗法的I 期临床试验。由此，Emily成为了第一个CAR-T疗法治愈的儿童白血病患儿，她的例子也让CAR-T疗法瞬间受到了极大的关注。

衍生的CTL-019疗法获得FDA批准后成为全世界第一个上市的CAR-T产品。

• 第三代CAR-T：

第三代CAR-T细胞，使用了慢病毒作为转染载体，可携带更大的基因片段进入T细胞。因此，CAR的胞内段往往可以包含两个共刺激域（CD28+4-1BB）。

一些临床前研究表明，与第二代CAR-T细胞相比，第三代CAR-T细胞的疗效有时更好，有些研究则没有发现差异，甚至疗效比第二代更差。因此，单纯在数量上添加共刺激分子区，并不一定能提升CAR对T细胞的活化效果，并不一定给CAR-T细胞疗法带来更好的疗效。

因此，第二代CAR-T仍然处于当前主流地位。

• 第四代CAR-T：

第四代CAR-T，也称为精准CAR-T细胞。截止到第三代CAR-T，已经知道CAR-T细胞可在患者体内存活长达10年以上，持久的生存期有利于CAR-T细胞长期监视并清除肿瘤细胞。但另一方面，CAR-T细胞也会因攻击体内正常细胞而产生巨大的毒性不良反应。有学者在第四代CAR-T的结构中添加了自杀基因或者可控性的自杀基因（例如某些药物敏感基因），从而实现对CAR-T细胞在体内存活时限进行控制。

近期，也有学者提出其他的设计思路，比如为CAR-T细胞设计一个安全开关，美国德州农工大学的研究人员设计发明了LiCAR-T (light switchable CAR-T) 细胞，在CAR的胞内部插入一个光开关蛋白LOV2 (light-oxygen-voltage domain 2)，它只有在特定蓝光激发下才能发挥功能，而在黑暗中回到“休眠”状态。

Kole T Roybal提出利用双靶点构造“与”门的疗法，被改造的T细胞只有同时识别两种抗原A和B时才能发挥杀伤作用，同样也可让T细胞只杀伤表达A但不表达B的细胞，也就是“非”门。这种CAR逻辑门可以提高CAR-T的精度，减少毒性伤害。

此外，还有学者在第四代CAR-T的设计中添加细胞因子或趋化因子受体结构，从而增加T细胞在肿瘤组织中的浸润，达到增强杀伤实体瘤的效果。

• 第五代CAR-T：

通常情况下，CAR-T疗法由患者自体T细胞在体外工程化然后回输，是极具个性化的疗法，一种疗法只针对一位患者，治疗成本极高。于是在研发第五代CAR-T技术时，学者们将目光聚焦在突破个体限制，实现规模化生产和治疗，以及降低成本上。

通用型CAR使用BBIR CAR (生物素结合免疫受体) 或SUPRA CAR (split、universal、programmable)这两种“第三方”系统，拆分胞外抗原靶向结构域和T细胞信号单位，以赋予CAR-T细胞识别多种抗原的能力。同时，从同种异体健康受体获取的T细胞，可在体外通过基因编辑技术(ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9)破坏T细胞的TCR基因和HLAⅠ类基因，消除移植物抗宿主病(GVHD)。

不过，目前这类通用型CAR-T也有较高的技术壁垒，对安全性的要求更高。目前国内通用型CAR-T的研究尚在萌芽期。

五、CAR-T细胞治疗生产制备全流程 

生产制备CAR-T细胞疗法的主要步骤包括：

① 分离和富集T细胞；

② T细胞活化；

③ 使用病毒或非病毒载体系统进行CAR基因转移；

④ 体外CAR-T细胞扩增；

⑤ 最后的末端工艺和冷冻保存。

整个制造周期一般需要2～4周。

但是，CAR-T细胞的生产制备失败率范围在2~14%，失败的原因主要来自细胞的个体差异、细胞数量以及细胞质量。

为最终实现CAR-T的商业化，努力优化和质量控制生产过程的各个环节都十分重要。

面对不同肿瘤患者复杂的样品来源，如何实现高效率、标准化、规模化的生产制备，在工艺上又可以通过哪些手段或方案来满足预期的商业化需求，是CAR-T制造商共同关注的问题。

数据来源：Current Opinion in Biotechnology 2018, 53:164–181.  A guide to manufacturing CAR T cell therapies  

• 第一步：细胞分离

生产CAR-T的第一步，是通过白细胞分离术从患者（或同种异体的供体）处收集外周血单核细胞（PBMC）；然后利用基于磁珠的技术分离出特定的T细胞亚群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞。

过程中既要考虑T细胞的回收率要高；同时要将粒细胞、红细胞、抗凝剂等对后续细胞生产有影响的杂质去掉。

在细胞处理的过程中采用封闭式、自动化的系统已成为行业共识。

封闭式、自动化：提高效率，减少污染、节省劳动力、便于跟踪；

传统手工开放式：周期长、污染风险大；

• 第二步：细胞激活
  

T细胞的激活通过T细胞受体（Signal 1）和CD28、4-1BB或OX40等共刺激信号（Signal 2），产生主要的特异性信号来实现。

自体抗原呈递细胞，例如树突状细胞（DC），是T细胞反应的内源性激活剂。然而，DC的效力因患者而异，很难作为T细胞激活的可靠来源。

激活会触发细胞分裂，从而促进基因转导，故细胞的激活方式与之后的基因转导效率息息相关。CD3/CD28抗体偶联的超顺磁微珠，例如Dynabeads，是目前用于T细胞活化最广泛使用的平台之一。

• 第三步：细胞改造：将CAR基因导入T细胞

实现CAR在T细胞上的表达，是CAR-T生产的核心技术，这一步需要利用到载体将CAR基因导入T细胞。理想的载体应该具有较高的基因转染效率、稳定性好，不引起机体免疫反应等特点。

目前有多种方法用于T细胞修饰，包括病毒载体转导（如γ-逆转录病毒、慢病毒载体等）及非病毒载体转染（转座子转染、电穿孔等技术等）。

已上市的5款CAR-T产品以病毒载体转导的方式为主：

① γ-逆转录病毒载体：吉利德旗下Kite的Yescarta和Tecartus；

②慢病毒载体：诺华的Kymriah、Juno的Breyanzi，百时美施贵宝/bluebird bio的Abecma。

• 第四步：细胞扩增和洗涤

通过基因修饰获得稳定的CAR-T细胞后，还需要进行大规模的体外扩增，才能获得达到治疗所需剂量，一般为十亿至百亿级别（根据患者体重和治疗周期决定）。

扩增T细胞仍是CAR-T疗法的关键挑战之一，有许多患者最终无法接受该疗法，原因就在于这些患者的T细胞无法在体外充分扩增，未达到目标剂量。

细胞可以通过不同的容器进行扩大：包括T瓶、平板或培养袋以及生物反应器。利用摇摆式生物反应器（例如WAVE）进行扩增，是目前主要的培养方式。

除此之外，自动化的细胞生产设备（例如CliniMACSProdigy）也能够生产出大量的CAR-T，这种自动化的设备比起摇摆式生物反应器能大大减少人为操作。

• 第五步：质量监控

目前，细胞治疗产品的质量控制分为四个大的方面，分别为安全性、纯度、效力以及均一性，这些质量控制会贯穿CAR-T生产的各个阶段。

安全性除了常规的内毒素、支原体及无菌外，如果采用病毒载体进行转导，还需保证病毒的高质量，避免存在RCR/RCL、低风险的整合特征等风险。

CAR-T的效价主要指T细胞的激活程度，由于T细胞的激活涉及一系列的细胞因子以及癌细胞的杀伤，因而真实效价往往难以获得。通常会选取有代表性的指标，如IFN-γ的表达，来评估T细胞的激活。

CAR-T的均一性和纯度则要对不同的细胞表面标志物进行检测，包括CAR-T细胞中的非目标细胞成份和杂质并限定其比例，包括NK细胞等；以及用于鉴别CAR-T细胞中目标T细胞的比例，例如%CD3+T细胞等。

CAR-T细胞的有效扩增和较长时间的体内存活是肿瘤治疗有效的先决条件。监控CAR-T的细胞增殖活性，让治疗持续性发挥效能。接着是CAR-T细胞的杀伤活性评估，CAR-T专一杀瘤效力也是CAR-T治疗关键的一环。除此之外，不容忽视的是治疗过程中可能引发的细胞因子风暴等免疫反应，常用的评估方式为流式细胞术与显微成像技术，和细胞因子等蛋白分析产品。

• 第六步：冻存

细胞扩增完成后，最终可能将达到~5L体积。标准流程中，回输给患者前CAR-T细胞需浓缩至一定体积并进行冻存。

冻存的步骤能够允许灵活安排患者的输液时间，以完成审查和放行所需的扩展质量控制测试。

采用经过验证的冻存方法对于大规模生产至关重要，从产品质量角度来看，冻存环节直接关系到最终回输给患者时的状态和数量，需要稳健的工艺支持，避免细胞活性变差、细胞数量损耗、污染的发生。因此，选择简单易操作、可更好保护细胞活力的细胞冻存液尤为重要。

无论使用何种制造模式，成功的CAR-T细胞生产依赖于整体流程的优化能力，包括流程的简化、产能的规划、生产的合规性和可扩展性等。

六、“CAR-T细胞治疗全流程”与“自动化智能化实现过程”之间的匹配

不止于此：

• 超高通量病毒核酸检测自动化解决方案

包括全自动化分拣样品管，核酸提取、PCR体系构建、自动封膜、在线qPCR扩增分析、自动出具报告等功能。

• 高通量蛋白药物发现和筛选自动化解决方案

本系统基于客户的药物开发需求，实现了高通量样品处理、高通量样品存储、高通量分子检测、高通量蛋白检测的全流程自动化。

• 自动化细胞系构建系统

实现从转染到稳转细胞单克隆筛选、鉴定等流程全自动化操作。

• 高通量药物筛选系统

整合从前处理到过程处理模块到检测设备的全流程解决方案，可整合如液体工作站、分液器、培养箱、离心机、酶标仪、高内涵成像设备等。

• 合成生物学解决方案

从克隆构建、基因编辑到产物纯化、酶活检测等全流程解决方案，可整合各种相关模块，如离心机、培养箱、克隆挑选模块、封膜机、撕膜机、PCR仪等即可提供单系统解决方案，又可提供多系统全流程解决方案，满足各种不同的需求。

后涉

截至2022年4月份，全球肿瘤免疫在研管线已有2756种处于活跃研发中的细胞治疗产品，相比2021年的2031种增加35.7%；2020年和2021年的增速分别为60.7%和43.3%。

有关专家对CAR-T细胞治疗的相关担忧与挑战，“基因外显子测序费用高昂，过去病人做一次基因测序需要五十多万元；抗原筛选技术还不成熟，要从上百万的基因测序结果中快速筛选出能表达肿瘤基因的新抗原，难度较大、花费的时间较长，有些病人等不起；抗原多肽及免疫细胞的制备工艺，还有待提升；规范的临床实验研究，以及入组受试者的数据总量不足等等。”

参考文献：

1. CAR-T细胞疗法是什么？一文读懂免疫疗法之星CAR-T细胞疗法！(baidu.com)

2.一文说透国内细胞治疗技术进程：产业一派欣欣向荣，资本快速跑马圈地(baidu.com)

3.CAR-T 疗法的发展简史|car-t疗法|细胞|car-t细胞|肿瘤 (qq.com)

4.CAR-T细胞治疗生产全流程_载体_病毒_基因 (sohu.com)

5.一文说透国内细胞治疗技术进程：产业一派欣欣向荣，资本快速跑马圈地(baidu.com)

6.上海汉赞迪生命科技有限公司官网www.biohandler.com